而经过三次的中量清水浣肠后，学姊们也开始了“真正”的浣肠。
她们被安排的浣肠顺序，其实并不是助教单纯想用多次的浣肠来凌虐、玩弄这些可怜的女孩们，而是有其意义的。
最初的三次中量清水浣肠，除了是让她们的肠道先适应浣肠之外，也是先对肠道进行初步的清洁；接着的中量甘油，因能刺激肠道蠕动，能够更进一步让较深处的污物在甘油的润滑下，被带到肠道末段进而排出，而后面的三轮高量的清水，当然就是为了洗掉肠道残存的甘油以及被甘油带出来的，原本积累在肠道深处未成形的软粪或其他残渣。
接着的气泡水，可以藉由气泡爆破的威力，将残黏在肠壁皱褶处的污物去除之外，也会稍微地将小量的肠壁黏膜剥离，将肠壁黏膜内的细胞组织曝露出来，才能让真菌成功扎根深入。
灌入培养液前的最后一步骤，是用低量的杀菌液，对肠内负责防御外来菌入侵的大肠菌进行轻微的杀菌，才能让要植入的真菌不会受到大肠杆菌等肠道共生菌影响而无法顺利生长或繁殖，但是因为那些共生菌实际上在肠道免疫上扮演着重要角色，如果太大幅度的破坏肠道的免疫功能，容易影响到女奴的健康，所以前面的多次浣肠，也是要彻底清洁肠道深处，使学姊们的肠道末段“裸露”的部位，在之后的数日不会被新产生、推送到肛门处的粪便污染、致病，就连杀菌液之后没再用可能含有其他病菌的清水灌洗，而是直接灌入事前经过杀菌处理及无菌培养环境下繁殖的真菌培养液，同样也是基于这原因。杀菌液是利用破坏细菌的胞壁消灭大肠菌，而真菌的胞壁结构成分与细菌不同不会受到影响，相对的，残存的杀菌液也能替培养液进行轻微的杀菌辅助，多少也能抑制可能溜进培养液中生长的外来病菌。